Chloroplast protein Extraction From Arabidopsis

 

Protocol from Isolation of chloroplast proteins from Arabidopsis thaliana for proteome analysis. Klaas J van Wijk , Jean-Benoit Peltier, Lisa Giacomelli. Methods Mol Biol. 2007:355:43-8. doi: 10.1385/1-59745-227-0:43.

Procedure:

1. Cut the filter membrane (EMD Millipore 1 PC × 1 ROLL) into small pieces and wet them with ddH2O;

2. Collect fresh plant tissue, add to 1L of Medium I and crush with a blender;

3.Filter the crushed sample through the filter membrane and transfer to a 50 ml centrifuge tube;

4. Centrifuge at 4 ℃ 4,200g for 5 minutes;

5. Discard the supernatant and add 1 ml of Medium II+sorbitol to the precipitate to homogenize the mixture;

6. Centrifuge at 4 ℃ 4,200g for 5 minutes;

7.Lyse chloroplasts : Discard the supernatant and add 1 ml of Medium II-Sorbitol to the precipitate to mix completely;

8. BSA method/Kamas Brilliant Blue staining method to measure the chloroplast protein concentration;

9. Add 5 x Laemelli Buffer to denature at 70 ℃ for 10 minutes, and store the sample at -40 ℃ after denaturation is complete.

 

Solutions Required

 

Medium I                         

0.33M  Sorbitol (M=182.17)                              60.12g

30mM  Tricine/KOH  (0.5M, pH 8.4)               40ml

5 mM  EDTA  (0.25M, pH 8.35)                         20ml

10 mM  NaHCO3  (M=84.01)                            20ml

                                                                                          

                                                        Add ddH2O to 1L

 

Medium II+sorbitol                       

0.3M  Sorbitol (M=182.17)                              13.66g

20mM  Hepes/KOH  (1M, pH 7.6)                     5ml

2.5 mM  EDTA  (0.5M, pH 8.0)                       1.25ml

5 mM  MgCl2  (M=203.3)                            0.255g

                                                                                          

                                                Add ddH2O to 250ml

 

Medium II-sorbitol                 

20mM  Hepes/KOH  (1M, pH 7.6)                    5ml

2.5 mM  EDTA  (0.5M, pH 8.0)                      1.25ml

5 mM  MgCl2  (M=203.3)                           0.255g

                                                                                          

                                               Add ddH2O to 100ml

 

5×Laemelli Buffer                  

1 M Tris-Hcl (PH=6.8)                               0.875mL

Glycerol                                                         4.5 mL

SDS                                                                    0.5g

0.25% Bromophenol blue                           0.5mL

2-ME                                                              1.25 mL

                                                                                          

                                                 Add ddH2O to 10mL